• Dr.Kaet

ตรวจพันธุกรรมแต่ละอย่างต่างกันอย่างไร ?

ในวันนี้หมอจะมาเล่าให้ฟังเกี่ยวกับเทคโนโลยีการตรวจสารพันธุกรรม โดยปกติเราตรวจพันธุกรรมกันเพื่อที่จะหาส่วนที่มีความผิดปกติ หรือแตกต่างจากคนทั่วไป (เราเรียกว่าการหา variant) หลายท่านคงเคยได้ยินกันมาว่าการตรวจพันธุกรรมนั้นมีหลายวิธี มีหลายรูปแบบ เช่น มีทั้งตรวจแบบหยาบ ๆ ตรวจแบบละเอียด ตรวจบางส่วน และตรวจทั้งหมด วันนี้หมอจะมาเล่าให้ฟังครับ ว่าจริง ๆ แล้วรูปแบบของการตรวจพันธุกรรมนั้นมีแบบไหนบ้าง ข้อดี ข้อเสียของแต่ละอย่างคืออะไร และการนำไปใช้เป็นอย่างไร



ก่อนที่จะเข้าถึงเทคโนโลยีการตรวจพันธุกรรมแต่ชนิด หมอขอเล่าพื้นฐานคร่าว ๆ เกี่ยวกับสารพันธุกรรมก่อนนะครับ ว่าโครงสร้างของ DNA นั้นเป็นอย่างไร รวมไปถึงการกลายพันธุ์(genetic variants) ที่เกิดขึ้นมีแบบไหนบ้าง เพื่อที่จะได้เห็นภาพว่าการตรวจสารพันธุกรรมแต่ละอย่างนั้นมีการตรวจที่ตรงไหนบ้าง

หากเราพูดถึงสารพันธุกรรม เราก็ต้องนึกถึง DNA ที่อยู่ภายในเซลล์ต่าง ๆ ของร่างกายเรา เกือบทุกเซลล์ของเรามีสารพันธุกรรมบรรจุอยู่ภายในนิวเคลียส ประโยชน์ของ DNA นั้นมีไว้เพื่อเป็นต้นแบบในการสร้างเซลล์ใหม่ ๆ (DNA replication) และมีไว้เพื่อเป็นต้นแบบในการผลิตสาย RNA และ โปรตีน(protein) ซึ่งตัว โปรตีน นี้เองที่จะมีหน้าที่ไปทำงานในส่วนต่าง ๆ ของร่างกายเรา หรือที่เราเรียกกันว่าการแสดงออกของยีน(gene expression)


DNA แต่ละตัวนั้นจะมีเบสเป็นองค์ประกอบ โดยจะมีเบสทั้งหมด 4 แบบ ได้แก่ A-Adenine, T-Thymine, C-Cytosine, G-Guanine เรียงต่อกันป็นสายยาวต่อเนื่องไป คนเรามี DNA ทั้งหมดประมาณ 3.2 พันล้านลำดับเบส ซึ่งสาย DNA นี้จะขดกันอยู่เป็นเกลียวโครโมโซม เพื่อให้มีขนาดเล็กลงไปอาศัยอยู่ในนิวเคลียสได้ คนเรามีโครโมโซมทั้งหมด 23 คู่ หรือ 48 แท่ง ซึ่งเราจะสามารถสังเกตเห็น โครโมโซได้เมื่อดูผ่านกล้องจุลทรรศน์ โดยเฉพาะขณะที่เซลล์กำลังแบ่งตัว


โดยหลัก ๆ แล้วเราจะแบ่ง DNA ได้เป็นสองส่วนนั่นคือส่วนที่เป็นยีน(Gene) และส่วนที่ไม่ใช่ยีน(non-gene)

ยีนเป็นส่วนของ DNA ที่สามารถถอดรหัสไปเป็นอาร์เอ็นเอนำรหัส หรือ mRNA และแปลรหัสต่อไปเป็นโปรตีน ยีนยังประกอบไปด้วยบริเวณที่ไม่แปลรหัส(untranslated region) หรือ UTR ซึ่งส่วนที่อยู่หน้าของยีนเรียก 5’UTR และส่วนท้ายของยีนเรียกว่า 3’UTR ส่วนของโพรโมเตอร์(promotor) ซึ่งมักอยู่ติดกับ 5’UTR ส่วนของตัวส่งเสริม(enhancer) และ ไซเรนเซอร์(silencer) ที่อยู่ห่างออกไปทั้งในส่วนของ 5’ และ 3’ UTR โพรโมเตอร์และไซเรนเซอร์เกี่ยวข้องกับการควบคุมการถอดรหัสยีนไปเป็นเอ็มอาร์เอ็นเอแรกสร้าง (pre-mRNA) ซึ่งจะถูกจัดการเพิ่มเติมโดยการนำส่วนที่เป็นอินตรอน(intron) ออกไปและนำเฉพาะส่วนที่เป็นเอกซอน(exon) มาต่อกันกลายเป็นลำดับกำหนดรหัส(coding sequence)



การแปรผันทางพันธุกรรม หรือ genetic variantion นั้นมีแบบไหนบ้าง


คำว่า variants นั้นหมายถึง มีการแปรผันทางพันธุกรรมไปจากคนปกติ(reference genome) โดยปกติคนเรามี DNA ที่เหมือนกันถึง 99.9% ส่วนอีก 0.1% ที่เหลือนั้นจะต่างกัน หาก variant นั้นเกิดขึ้นที่ตำแหน่งไม่สำคัญบน DNA หรือไม่ก่อให้เกิดความผิดปกติของการแสดงออกของยีนมากนัก ก็อาจจะไม่ก่อให้เกิดความผิดปกติทางพันธุกรรมแต่อย่างใด หรืออาจจะก่อให้เกิดเพียงความหลากหลายในประชากร(polymorphism) อย่างเช่นตาสีดำ ตาสีฟ้า ในทางตรงกันข้ามหาก variants เกิดขึ้นที่ตำแหน่งสำคัญ หรือทำให้การแสดงออกของยีนเปลี่ยนไปจากปกติมากจนเกินไป ก็จะทำให้เกิดโรคทางพันธุกรรมขึ้นมานั่นเอง


Genetic variation มีแบบใดบ้าง
  • มีการเปลี่ยนแปลงเพียงลำดับเบสเดียว หรือ Single base-pair substitution หรือ single nucleotide polymorphisms (SNPs) หรือ single nucleotide variants(SNVs)

  • แบบ Insertion หรือ deletion หรือที่เรียกกันว่า indels หมายถึงมีการเพิ่มเข้ามา หรือหายไปของ DNA สายสั้นๆตั้งแต่ 2 ลำดับเบส ไปจนถึงหลักร้อยลำดับเบส

  • Structural variants หรือแบบที่มีการเปลี่ยนแปลงเชิงโครงสร้าง มักจะเกิดจากการเปลี่ยนแปลงลำดับเบสขนาดใหญ่หรือจำนวนมาก ซึ่งมีหลายชนิดย่อยๆลงไปได้แก่

  • Deletion

  • Insertion

  • Inversion

  • Duplication

  • Copy number variation(CNVs)

  • Rearrangement

การตรวจทางพันธุกรรมนั้นมีความเกี่ยวข้องกับชีวิตเราเป็นอย่างมาก เริ่มตั้งแต่เรายังไม่เกิด แรกคลอด ตอนเป็นเด็ก ตอนเป็นผู้ใหญ่ ไปจนกระทั่งเราเสียชีวิตไปแล้วก็ยังถูกนำมาใช้อยู่เสมอ

  • เมื่อตอนที่เราแรกคลอด จะมีการตรวจที่เรียกว่า newborn screening หากตรวจพบว่ามีปัญหาก็จะให้การวินิจฉัยได้ไว และเริ่มการรักษาได้ไว

  • ช่วงเป็นเด็ก หากคุณหมอมองเห็นความผิดปกติที่เกิดขึ้น ไม่ว่าทางร่างกาย หรือพัฒนาการ ซึ่งบ่งชี้ถึงความผิดปกติทางพันธุกรรม ก็จะส่งตรวจ DNA เพื่อทำการวินิจฉัยโรคที่สงสัย เมื่อได้การวินิจฉัยแล้วก็จะมีการให้คำปรึกษา คำแนะนำ พยากรณ์โรค รวมไปถึงโอกาสเกิดบุตรคนอื่นๆผิดปกติในครอบครัว และมีการรักษาได้อย่างตรงจุดตามที่ยีนนั้นๆบกพร่อง นำมาซึ่ง Tailored treatment ได้แก่ Drug/theraputics, Gene therapy/Antisense oligo therapy(ยับยั้ง mRNA ไม่ให้ทำงาน), CRISPR(ตัดต่อพันธุกรรม แต่ยังอยู่ในช่วงการทดลอง)

  • ช่วงที่โตขึ้นมาเป็นวัยรุ่นหรือผู้ใหญ่ ก็สามารถตรวจได้อีกหลายอย่าง ตั้งแต่ Predipositional screening(หาความเสี่ยงในการเป็นโรคต่างๆในอนาคต หากพบว่ามีความเสี่ยงก็ทำ counseling(ให้คำแนะนำ และทางเลือกลดความเสี่ยงในการเกิดโรค) และประเมิน surveillance(พยากรณ์โรค) หรือการทำ carrier screening เพื่อวางแผนในการมีบุตร

  • นอกไปจากนั้น สิ่งที่ทำได้ทุกช่วงอายุเพิ่มเติมได้แก่ Phamacogenomics(ตรวจพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับการใช้ยา) เพื่อที่จะได้ยาแบบถูกต้องตามยีน รวมถึงขนาดของยาที่เหมาะสมกับร่างกายแบบจำเพาะบุคคล หรือการทำ Tumor panels ในกรณีที่เป็นมะเร็งแล้ว เพื่อที่จะหา driver mutation(ยีนที่ส่งผลให้เกิดมะเร็ง) เพื่อที่จะได้เลือกยาที่จำเพาะ หรือการรักษาที่ตรงจุดต่อไป

ถัดมาจะเข้าถึงเรื่อง DNA เทคโนโลยีที่ใช้กันอยู่ในปัจจุบัน ไม่มีการตรวจแบบไหนดีที่สุด ขึ้นอยู่กับว่าเราต้องการที่จะตรวจหาอะไร เนื่องจากแต่ละวิธีจะมีจุดเด่นเป็นของตัวเอง และการเลือกเทคโนโลยีให้ถูกต้องจะสามารถช่วยลดค่าใช้จ่ายในการตรวจลงได้ และเกิดประโยชน์มากที่สุด


การตรวจวิเคราะห์ DNA มีตั้งแต่ตรวจวิเคราะห์เพียงจุด ๆ เดียว ไปจนกระทั่งตรวจทั้งหมดของ DNA(genome) เรามาดูกันว่าระหว่างการตรวจแบบวิเคราะห์บางจุด (Selected variants) (ซึ่งอาจจะเป็นการเปลี่ยนแปลงเพียงลำดับเบสเดียวอย่าง SNPs หรือ varaints แบบอื่น) เมื่อเปรียบเทียบกับการตรวจทั่ว ๆ ยีน(Entire gene) และการตรวจทั่วโครโมโซม(Entire chromosome) นั้นมีความแตกต่างกันอย่างไร


การตรวจแบบวิเคราะห์บางจุด (Selected variants) คือการเลือกตรวจเฉพาะจุดย่อย ๆ แบบเฉพาะเจาจงสำหรับโรคบางโรคนั้นเกิดขึ้นมาจากการแปรผันทางพันธุกรรมเพียงแค่จุดหรือสองจุด เรามักเรียกว่าการทำ genotyping ยกตัวอย่างเช่น

- หากต้องการหายีนที่เป็นสาเหตุทำให้เกิดโรค Factor V Leiden เราก็จะทำการตรวจยีนที่มีชื่อว่า HFE เพียงแค่ 2 จุด ได้แก่ตำแหน่ง p.Cys282Tyr (p.C282Y) และตำแหน่ง p.His63Asp (p.H63D) แบบจำเพาะเจาะจงก็เพียงพอ เหมาะสมกับการใช้งาน

- การตรวจหาความเสี่ยงของการเกิดมะเร็ง ในครอบครัวโดยที่รู้อยู่แล้วว่ามียีนก่อโรคของมะเร็งอะไรแฝงอยู่ ยกตัวอย่างเช่นตรวจหา pathogenic BRCA1 variant ในครอบครัวที่มีเชื้อสายเป็นมะเร็งเต้านมที่เคยตรวจพบ pathogenic BRCA1 variant มาก่อน

- การตรวจแบบ genotyping panels หรือ SNPs arrays เพื่อหาความเสี่ยงในการเกิดโรคที่เจอได้บ่อยแบบซับซ้อน (common, complex diseases) หมายถึงการตรวจการแปรผันทางพันธุกรรมหลายจุด ทีละหลายยีน หรือในส่วนที่ไม่ใช่ยีน อย่างเช่น โรคเบาหวานชนิดที่สอง โรคแพ้ภูมิตนเอง โรค metabolic(ความดันโลหิตสูง โรคไขมันในเลือดผิดปกติ) คำว่า complex diseases หมายถึงมีความซับซ้อนทางด้านพันธุกรรมอยู่ การที่มี variants เพียงตัวเดียว หรือไม่กี่ตัวมักจะทำให้เกิดความเสี่ยงในการเป็นโรคไม่มากนัก (odds ratios of <1.5 สำหรับ risk variants) รวมถึงมีปัจจัยทางด้านสิ่งแวดล้อมเข้ามาเกี่ยวข้องมาก


การตรวจทั่วทั้งยีน(Entire gene) คือการเลือกตรวจทั้งยีนนั้น ๆ เลย ใช้สำหรับโรคที่มีโอกาสจะเกิดจากความผิดปกติได้หลายตำแหน่ง ในยีนนั้น ๆ ยกตัวอย่างเช่น โรคมะเร็งเต้านมและรังไข่ (Breast and ovarian cancer) เราจะตรวจหาทั้งยีน BRCA1 และ BRCA2 โรค cystic fibrosis เราจะตรวจหาทั้งยีน CFTR เพื่อที่จะให้ได้ข้อมูลอย่างเพียงพอ

การตรวจแบบทั่วๆยีน(Entire gene) สามารถแบ่งออกได้หลายอย่างดังนี้

- Single-nucleotide genotyping panels คือการตรวจเฉพาะจุดลำดับเบสที่มีความเสี่ยงสูงที่จะทำให้เกิดโรคนั้น ๆ ยกตัวอย่างเช่น การตรวจคัดกรองโรค cystic fibrosis โดย panels ตรวจหา variants บน CFTR gene ทั้งหมด 25 จุด ซึ่งการตรวจแบบดังกล่าวครอบคลุมโอกาสเกิดโรค cystic fibrosis กว่า 90% ในประชากรแล้ว ก็นับเป็นการการเลือกวิธีตรวจได้สมเหตุผล เนื่องจากประหยัดค่าใช้จ่าย และสามารถตรวจได้ผลไว หากผลออกมาป็นลบก็ยังมีโอกาสเกิดโรคได้บ้าง(rare variants) ขึ้นอยู่กับแพทย์ที่ดูแลว่ายังสงสัยโรคดังกล่าวหรือไม่ หากสงสัยก็อาจตรวจเชิงลึกลงไปเพิ่มเติม

- Sequencing คือการตรวจทุกลำดับเบสบนยีนที่เราสนใจ การทำ Sequencing อาจจะทำที่ยีน ๆเดียวก็ได้ หรือทำบนหลายยีน(gene panels) หรือทุกยีน(WES) หรือทำทุกลำดับเบสของ DNA(WGS) ขึ้นอยู่กับว่าเราสงสัยโรคอะไร และการกำเนิดโรคนั้น ๆ เกิด variants แบบใดได้บ้าง ที่ตำแหน่งไหนได้บ้าง เรามักจะใช้ Sequencing ในกรณีที่ใช้หา varaiants ทุกความเป็นไปได้ที่จะทำให้เกิดโรคนั้น ๆ (หา rare variants) ยกตัวอย่างเช่นตรวจยีน F9 ในคนเป็นโรค hemophilia B หรือทำการตรวจหลาย ๆ ยีน(WES) ในเด็กที่มีพัฒนาการช้า นอกไปจากนั้นการ Sequencing ยังสามารถหา structural variants หลาย ๆ รูปแบบได้อีกด้วย

- ตรวจระดับโครโมโซม(entire chromosome) โรคบางอย่างที่มีความผิดปกติเชิงโครงสร้างขนาดใหญ่ อย่างที่เราเคยได้ยินกันบ่อย ๆ นั่นคือ Down syndrome(trisomy 21) หรือโรคอื่นๆไม่ว่าจะเป็นแบบ aneuploidies, Segmental chromosomal gains or losses(CNVs), chromosome translocations หรือ structural rearrangements การตรวจระดับ Entire chromosome จะไม่จำเป็นต้องหาละเอียดถึงลำดับเบส จะมองหาความผิดปกติระดับใหญ่เชิงโครงสร้างเป็นหลัก ตัวอย่างการตรวจ entire chromosome ได้แก่ karyotyping, fluorescence in situ hybridization (FISH), chromosomal microarrays รวมไปถึงการตรวจความผิดปกติของเด็กในท้องระหว่างตั้งครรภ์ด้วยวิธี noninvasive prenatal screening (NIPS) ก็ใช้วิธีนี้เช่นเดียวกัน


ต่อมาเราจะเข้าเรื่องเทคโนโลยีการตรวจรูปแบบต่างๆกันครับตั้งแต่ DNA fingerprints, karyotyping, fluorescence in situ hybridization (FISH), chromosomal microarrays, SNPs arrays, gene panels, WES, WGS ว่ามีลักษณะแตกต่างกันอย่างไร โดยเราจะเริ่มจากการตรวจ DNA แบบที่ความละเอียด่ำสุดก่อน


DNA fingerprints

- DNA fingerprints นั้นมีที่ใช้ในการระบุตัวบุคคล มักใช้ในงานนิติเวชน์ เช่น หาตัวคนร้าย ใช้หาความเป็นไปได้ระหว่าง พ่อ แม่ และบุตร โดยใช้หลักการวัดน้ำหนักของ DNA โดยเริ่มจากการตัด DNA ออกเป็นชิ้นย่อย ๆ แล้วนำ DNA เหล่านั้นไปเคลื่อนที่ผ่านเจลไฟฟ้า ชิ้นส่วนของ DNA ที่มีน้ำหนักมากจะเคลื่อนที่ได้น้อย ส่วนชิ้นส่วนของ DNA ที่มีน้ำหนักน้อย จะเคลื่อนที่ได้ไกล ดังนั้นหากเป็นคนคนเดียวกัน หรือเป็น พ่อ แม่ บุตรกัน ก็จะมีชิ้นส่วนของ DNA ที่เคลื่อนที่ระยะทางเท่ากันอยู่


karyotype

- Karyotype และ FISH มักใช้ในการหาความผิดปกติเชิงโครงสร้าง(structural varaints) ที่มีขนาดใหญ่ อย่างเช่นโรค Down syndrome, Edward syndrome, Digeorge syndrome หรือ plateau syndrome รวมไปถึงโรคอื่น ๆ ที่เกิดจากความผิดปกติเชิงโครงสร้าง ข้อดีคือค่าใช้จ่ายต่ำ ทำได้ง่าย แต่ข้อเสียคือไม่สามารถระบุได้ถึงลำดับเบสที่เปลี่ยนไป



- Microarrays หมายถึงแผ่นซึ่งมักทำมาจากแก้ว หรือวัสดุอื่นใด ที่มี oligonucleotide probe(DNA สายสั้น ๆ) เคลือบอยู่จำนวนหนึ่ง ซึ่ง DNA จะมีลำดับเบสแบบไหนนั้นขึ้นอยู่กับผู้ผลิต หรือผู้ที่ต้องการจะใช้งานจะออกแบบให้จำเพาะกับ varaint ที่ต้องการหา ไม่ว่าจะป็น varaint ที่ตำแหน่งใด หรือของโรคอะไร หากมีความเข้ากันได้ของสายที่ออกแบบมา reference sequence(probe) กับชิ้นส่วนของ DNA ผู้ป่วย ก็จะเกิดแสง fluorescent ขึ้นทำให้เครื่องอ่านค่าได้ microarray มักจะใช้ในงานศึกษาวิจัยแบบ genome-wide association studies (GWAS) เป็นงานวิจัยที่ศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง variants กับความเสี่ยงในการเกิดโรค หรือลักษณะทางพันธุกรรมต่าง ๆ microarrays มีหลายแบบ แบ่งออกเป็น

  • chromosomal microarray ใช้ในการหาความผิดปกติเชิงโครงสร้างแบบ coppy number variants(CVNs) นอกจากใช้หา CNVs ได้แล้วยังสามารถใช้ดู sequence สายสั้น ๆ ประมาณ 25 ลำเบส ได้อีกด้วย

  • SNPs arrays หรือ genotyping arrays หรือ genotyping panels เป็น arrays ที่ถูกออกแบบมาเพื่อหาการแปรผันทางพันธุกรรมแบบ single nucleotide polymorphisms(SNPs) โดยเฉพาะ

  • Combination arrays คือเป็น arrays ที่ผสมกันระหว่าง chromosomal microarray และ SNPs arrays จัดได้ว่าดีที่สุด เนื่องจากสามารถหาได้ทั้ง CNVs และ SNPs


after SM Carr et al. 2008. Comp Biochem Physiol D, 3:11
DNA microarray chip

ข้อดีของการตรวจแบบ microarrays คือ สามารถใช้หา variants ได้เป็นจำนวนมากในการตรวจเพียงแค่ครั้งเดียว ตรวจหา variants ได้ทั้งในส่วนที่เป็นยีน และส่วนที่ไม่ใช่ยีนอีกด้วย ทั่วตลอดทั้ง genome ในบางสถานการณ์จะจัดว่าการตรวจแบบนี้คุ้มค่าใช้จ่ายเป็นอย่างมาก เช่นการใช้ CFTR genotyping panels ในการตรวจหาโรค cystic fibrosis

ข้อเสียของการตรวจ microarrays คือ จะสามารถหา variants ได้จำเพาะ ขึ้นอยู่กับชิป หรือ probe ที่ถูกออกแบบมา ทำให้มีโอกาสพลาดหรือตรวจไม่พบ rare variants และ SNPs arrays ไม่สามารถจะใช้ตรวจหา structural variants ได้เนื่องจากถูกออกแบบมาเพื่อให้หา SNPs



- Next generation sequencing(gene panels, WES, WGS) การตรวจแบบ NGS นับเป็นการตรวจลำดับเบสจำนวนมากในเวลาเดียวกัน เข้ามามีบทบาทมากขึ้นเนื่องจากค่าใช้จ่ายในการตรวจที่ต่ำลง แต่อย่างไรก็ตาม การตรวจในรูปแบบเก่าอย่าง Sanger sequencing(วิธีตรวจหาลำดับเบส sequencing แบบดั้งเดิม ใช้ตรวจหาลำดับเบสประมาณ 500-900 ตำแหน่ง) ก็ยังได้ใช้อยู่เนื่องจากมีความแม่นยำสูง ใช้เป็น gold standard test เมื่อพบเจอ variants จาก NGS เนื่องจากเทคโนโลยี NGS มีโอกาสตรวจผิดพลาดอยู่บ้าง ความแม่นยำของการตรวจ NGS นั้นอยู่ที่ปริมาณ depth of coverage ซึ่งหมายถึงปริมาณการอ่านลำดับเบสตัวนั้นซ้ำ ๆ กันกี่รอบ หากมีค่ามาก เช่น 50X-100X หมายถึงเครื่องทำการอ่านลำดับเบสตัวนั้น 50 - 100 รอบ ทำให้มีความแม่นยำที่ตำแหน่งนั้นสูง ในทางกลับกันหาก depth of coverage มีค่าน้อย(เช่น 30X) จะทำให้ความน่าเชื่อถือต่ำลง ปริมาณ depth of coverage จะขึ้นอยู่กับความสามารถของตัวเครื่อง และบริเวณต่างๆของ DNA ว่าจุดนั้นสามารถอ่านลำดับเบสได้ยากหรือไม่ Next generation sequencing นั้นมี 2 แบบนั่นคือแบบ short read และแบบ long read หมายถึงอ่านแบบสายสั้นกับแบบสายยาว เทคโนโลยีแบบ long read นั้นยังใหม่อยู่ มีค่าใช้จ่ายที่สูง และมีโอกาสอ่านลำดับเบสที่ผิดพลาดสูง ประโยชน์ของ long read นั้นมีอยู่สองอย่าง คือ ใช้ตรวจหา repetitive regions(ตำแหน่งที่มีลำดับเบสซ้ำๆ) อย่างเช่นโรค fragile X syndrome เนื่องจาก มีลำดับเบสแบบ CGG อาจจะซ้ำกันมากกว่า 1,000 จุด ทำให้ short read ไม่สามารถหาจำนวนที่แท้จริงได้ ประโยชน์อย่างที่สองนั่นคือใช้ตรวจหา structural variants โดยเฉพาะที่ซับซ้อน หรือ large deletion ได้ดี ยกตัวอย่างเช่น variant ของมะเร็ง ตำแหน่งที่มี large deletion หากทำ short read จะเกิด low depth of coverage


NGS

- Whole exome sequencing(WES) เป็นการตรวจแบบหาลำดับเบสทั้งหมดเฉพาะส่วนที่เรียกว่า exon ซึ่งมีอยู่ประมาณ 1.5-2% ของจำนวน DNA ทั้งหมด(หรือประมาณ 30 ล้านลำดับเบส) สำหรับส่วนที่เหลือเช่น intron, promoter, enhancer และ silencer การตรวจแบบ WES จะไม่สามารถหาลำดับเบสส่วนดังกล่าวได้

ข้อดีของการตรวจ WES คือ มีความคุ้มค่าในการตรวจในบางสถานการณ์ โดยเฉพาะกรณีที่เป็นโรคทางพันธุกรรมแบบหายาก เนื่องจากมักจะเกิดจาก variants ที่อยู่บน Protein coding region หรือส่วนที่มาจาก exon และการตรวจหา variants ที่ exon มักจะสามารถตีความหรือวิเคราะห์ variants เหล่านั้นได้ง่าย เนื่องจากมักจะส่งผลต่อระดับ protein ที่ชัดเจน และยังมีปริมาณ Data ที่ได้มานั้นไม่มาก ทำให้ไม่เปลืองพื้นที่ในการจัดเก็บไฟล์

ข้อเสียของการตรวจ WES คือ เราจะพลาด variants ที่ก่อให้เกิดโรคในส่วนที่ไม่ใช่ exon ทั้งหมด หรือที่อยู่ใน non-coding region หมายความว่าเราจะไม่สามารถตรวจพบความผิดปกติในตำแหน่งนอก exome


- Whole genome sequencing(WGS) เป็นการตรวจลำดับเบสทั้งหมดของ DNA ที่ได้มาทั้งจีโนม(genome) ซึ่งมีความยาวถึง 3.2 พันล้านลำดับเบส ปัจจุบันนี้เริ่มเป็นที่นิยมมากกว่า WES เนื่องจากราคาที่ถูกลง และได้ข้อมูลครบถ้วนทุกอย่าง

ข้อดีของการตรวจแบบ WGS ได้แก่ เราจะได้ข้อมูลของ DNA ทั้งหมดที่มี และ varaints เกือบทุกรูปแบบ

ข้อเสียของการตรวจแบบ WGS คือ ข้อมูลที่ได้มาบางครั้งมากเกินไป จะตรวจพบ varaints ปริมาณมาก ซึ่งบางครั้ง varaints เหล่านั้นไม่ก่อให้เกิดความผิดปกติอะไรต่อรางกายเลย ทำให้ตีความ varaints เหล่านั้นได้ยาก และหลายๆ varaints ที่อยู่นอก exome เรายังไม่รู้หน้าที่ของมันแน่ชัดหรือเป็น variants of uncertained significance (VUS) อาจจะทำให้ผู้ที่ได้รับการตรวจกังวลใจกับผลตรวจที่ได้รับ


- Targeted gene panels(gene panels) เป็น panels ที่ออกแบบมาเพื่อให้เข้ากับการหากลุ่มของโรค หรือกลุ่มของอาการให้ได้ตรงจุดที่สุด มักจะทำการ sequence ยีนจำนวนตั้งแต่ 10 ไปจนถึง 200 ยีน ยกตัวอย่างการใช้ gene panels เช่น การตรวจหาความผิดปกติของยีนในโรค hereditary early-onset and/or familial nonsyndromic hearing loss(หูหนวก) ซึ่งกลุ่มโรคดังกล่าวสามารถเกิด variants ขึ้นได้ทั้ง 60 ยีน จึงจำเป็นต้องใช้ gene panels ที่จำเพาะสำหรับกลุ่มของโรคหูหนวกนี้

Gene panels ยังมีที่ใช้ในจุดอื่นๆอีกมากมาย เช่น ใช้ตรวจหา variants ก่อมะเร็ง(hereditary cancer syndromes) ใช้ตรวจหา variants ของโรคกล้ามเนื้อหัวใจ (hereditary cardiomyopathies) ให้ตรวจหา variants ที่ก่อให้เกิดโรคปอด (lung diseases)

ข้อดีของการตรวจแบบ gene panels ได้แก่ ความแม่นยำในการหา variants ค่อนข้างสูง เนื่องจากการตรวจในลักษณะนี้มักมี depth of coverage ที่สูงมาก

ข้อเสียของการตรวจแบบ gene panels คือจะสามารถหาได้เฉพาะ variants ของกลุ่มโรค กลุ่มอาการนั้นๆ ตามแต่โรงงานจะผลิต panels ออกมา เนื่องจากปัจจุบัน gene panels ที่ทำออกมา หา variants ได้เพิ่มขึ้นไปจนถึง 1000 ยีนแล้วจึงทำให้บางครั้งตรวจพบ variants โดยบังเอิญ ซึ่งอาจจะไม่ก่อให้เกิดโรคในประชากรนั้นแต่อย่างใด ทำให้เกิดความกังวลใจในผู้ได้รับการตรวจ และอาจจะเกิดการรักษาที่มากเกินเหตุได้เช่นกัน


Reference :

- ชีวะสารสนเทศ 1 แนวทางอัลกอริทึม

- https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/human-genetic-variation-introduction/

- https://www.uptodate.com/contents/next-generation-dna-sequencing-ngs-principles-and-clinical-applications?sectionName=TERMINOLOGY%20AND%20EVOLUTION%20OF%20TECHNOLOGIES&search=genetic%20sequencing%20teqnology&topicRef=2901&anchor=H22497283&source=see_link#H22497411

- https://www.uptodate.com/contents/next-generation-dna-sequencing-ngs-principles-and-clinical-applications?sectionName=TERMINOLOGY%20AND%20EVOLUTION%20OF%20TECHNOLOGIES&search=genetic%20sequencing%20teqnology&topicRef=2901&anchor=H22497283&source=see_link#H22497411